Az elszabadult láncreakció, ami megváltoztatta a molekuláris biológiát – ezért hívják PCR- tesztnek a COVID-kimutatás módszerét

Több mint nyolcmilliárd dollárra büntették a Purdue gyógyszergyárat az opiátválságban játszott szerepéért
2020-10-23
Magyar kutatóorvosok áttörést értek el a tartós izomgörcsök kezelésében
2020-10-24
Show all

Az elszabadult láncreakció, ami megváltoztatta a molekuláris biológiát – ezért hívják PCR- tesztnek a COVID-kimutatás módszerét

Ha van olyan rövidítés, ami meghatároz egy teljes évet, akkor az idén ez egyértelműen a PCR, vagyis a polimeráz-láncreakció. A koronavírus megbízhatónak tekintett kimutatása e ma már rutinszerű laboratóriumi eljáráson alapszik. Általa vált lehetővé, hogy a mintákban szinte elhanyagolható mennyiségben jelen lévő genetikai anyagot kimutathatóvá szaporítsuk. De a hepatitisz-C vírus idei orvosi Nobel-díjjal jutalmazott felfedezése ugyancsak lehetetlenség lett volna a technológia nélkül. Miközben a PCR-t vitán felül a molekuláris biológia legnagyobb mérföldkövei között fogja számontartani a tudománytörténet, kifejlesztője már nem az a hősfigura, akire szívesen nézne föl mindenki.

Kevés Nobel-díjas tudós van, akinek nekrológjában fontosnak tartják kiemelni, hogy „fura” (weird) volt. A közvélemény nem is annyira legnagyobb alkotását, a polimeráz-láncreakciót jegyezte meg róla, hanem sokkal könnyebben értelmezhető megnyilvánulásait: amikor kétségbe vonta a globális felmelegedés tényét, vagy amikor nem hitte el, hogy a HIV okozza az AIDS-et, esetleg, amikor szakértőként segítette O. J. Simpson ügyvédeit, miközben az amerikai futballista-filmsztárt felesége megölésével vádolták.

Kary Mullis e performanszaihoz képest az már szinte említésre sem méltó, hogy céget alapított, amely hírességek DNS-ét tartalmazó ékszereket árult. Ennek ellenére, amikor tavaly augusztusban, 74 éves korában tüdőgyulladásban elhunyt, a közelmúlt legnagyobb hatású tudósai között tartották számon. Méghozzá egy dolog miatt, ez pedig a PCR kifejlesztése. Az eljárásért 1993-ban (egészen fiatalon, 48 évesen) megkapta a megosztott kémiai Nobel-díjat. Bár a kitüntetést Michael Smith-szel közösen kapták, a PCR felfedezésének érdeme szinte teljes egészében az övé, Smith a sokkal kevésbé ismert folyamat, az oligonukleotid alapú mutagenezis felfedezéséért részesült az elismerésben.

Kary Mullis a felfedező

Kary Mullis a felfedező

A PCR fontosságához tudni kell, a molekuláris biológusok mindig is azzal az alig megoldható
problémával voltak kénytelenek szembenézni, hogy a vizsgálni kívánt gének gyakorlatilag kimutathatatlanul kis mennyiségben vannak jelen a mintában. Erre kínált hatékony és nagyon gyors megoldást a polimeráz-láncreakció (PCR), amelynek segítségével sok nagyságrenddel lehetett felszaporítani a megcélzott génszakaszt.

A Nature először elutasította a PCR-ről beszámoló cikket

Mullis nem a semmiből találta fel a polimeráz-láncreakciót, hiszen ehhez szüksége volt a gének működésének ismeretére. Ahogy az sem következik az 1985-ös eredményeket egészen gyorsan, nyolc évvel később követő díjazásból, hogy a tudóst és vívmányát már a kezdet kezdetén a keblére ölelte volna a tudományos közösség. Olyannyira nem, hogy a PCR kifejlesztéséről beszámoló közlemény nem kellett a Nature-nek, végül a Methods in Enzymology szakfolyóirat hozta le. A világ legnagyobb tudományos folyóiratának szerkesztői valószínűleg nem ezt az elutasítást tartják pályafutásuk legjobb döntésének.

De hogyan is működik a polimeráz-láncreakció, és miért bizonyult paradigmaváltónak a biotechnológiában? Ahogy minden a molekuláris genetikában, e történet is az örökítő anyag, a DNS kettős spirál-szerkezetének 1953-as felfedezésével kezdődik. James Watson és Francis Crick rövidke tanulmányukat e mondattal zárták:

Nem kerülte el figyelmünket, hogy a [nukleotidok – a DNS-t alkotó bázis részegységek] általunk felvázolt specifikus párba állása azonnal valószínűsíti a genetikai anyag lehetséges másolómechanizmusát.

Vagyis tisztában voltak azzal, hogy ilyen komplex szerkezet nem jöhet létre csak úgy magától, hanem csak erre szakosodott molekuláris eljárások, s az ezt végző vélhetően enzimek révén. De ezeket az enzimeket abban a pillanatban még senki sem ismerte.

Az újabb áttörésre csak négy évet kellett várni, amikor Arthur Kornberg (aki e történet sok más szereplőjéhez hasonlóan ugyancsak Nobel-díjat kapott két évvel később ötletéért), a St Louis-i Washington Egyetem kutatója felfedezte a DNS másolásának mechanizmusát, vagyis a DNS-polimeráz enzimet. Az adatokból úgy tűnt, hogy az enzim meglehetősen finnyás, és nagyon jól előkészített körülményeket igényel a működéséhez. Jelesül csak szétválasztott, tehát egyszálú DNS-en tud dolgozni, szüksége van kezdeti, primer szakaszra az elinduláshoz, majd ezután csak egy irányban tud haladni a hosszú molekulaláncon.

Hamarosan kiderült, hogy a DNS lemásolásához egész sor enzimre van szükség. Külön enzim gondoskodik a spirálszerű kettős DNS-lánc zipzárszerű szétválasztásáról, egy másik arról, hogy e szálak ne kapcsolódjanak azonnal össze újból. Újabb enzim készíti a primert (vagyis azt a kódsorozatot, amelynél a másolóenzim elkezdi a munkát), a polimeráz enzim építi fel a DNS-t a különálló nukleotidokból (nukleinsav-építőelemekből), majd egy másik fehérje távolítja el a
primert és egy következő illeszti össze a szálakat.

A következő negyedszázad fokozatos, de folyamatos fejlődéssel telt. Az indiai-amerikai Gobind Khorana feltárta a genetikai kód működését, és megtette az első lépéseket a mesterséges nukleinsavak létrehozásának irányába (természetesen ő is Nobel-díjas, 1968-ból). Elkezdte kidolgozni azokat a technológiákat, amelyek segítségével meghatározott szekvenciájú oligonukleotidokat (kevés építőegységet tartalmazó nukleinsav-darabkákat) lehet építeni.

1969-ben a Yellowstone Park egyik hőforrásában egy addig ismeretlen, hőtűrő baktériumot, a Thermus aquaticust (rövidítve Taq) fedeztek fel, amelynek különlegessége az volt, hogy fehérjéi magas hőmérsékleten sem veszítették el működőképességüket. De ne szaladjunk ennyire előre, hiszen a hetvenes években, részben a már szerepelt Gobind Khorana kutatócsoportja egészen közel jutott a PCR-hoz, legalábbis elméleti kontextusban már olyan rendszert vizionáltak, amelyben két enzim, két primerből indulva egymással szemben replikálja a DNS-t.

Csakhogy valószínűleg nem jutottak túl az elméleten, legalábbis nem publikálták az eljárás működőképességét bizonyító kísérletek eredményeit.

A hetvenes évek közepén a Thermus aquaticusból sikerült izolálni a Taq polimerázt, amely a forróságban (75 Celsius-fokon) sem ment tönkre, és e tulajdonsága esszenciális lesz később, a PCR melegítési fázisában. Egy évvel később (az 1980-ban Nobel-díjban részesült) Frederick Sanger új alapokra helyezte a DNS-szekvenálást. Sanger Nobel-díja átadásának idején – bár ezt természetesen akkor senki sem sejtette – valójában már minden tudásnak a birtokában volt az emberiség, ami a PCR-hoz szükséges. A DNS-polimerázt is rutinszerűen használták a laborokban az oligonukleotidok lánchosszabbítására. Csak az isteni szikra hiányzott.

Mullis útja asztrofizikától a pékségen át az íróságig

Itt lép a történetbe Kary Mullis, aki már az egyetemen sem volt átlagos képességű hallgató, hiszen kevesen vannak, akik a diploma előtt egyszerzős tanulmányt közölnek a Nature-ben. Ez a cikk egyébként kozmológiai témájú volt, mert Mullist akkor épp az asztrofizika érdekelte. Aztán biokémiai doktorálása után a Kansasi Egyetemen végzett posztdoktori kutatásokat a gyermek kardiológia területén, majd a San Franciscó-i Kaliforniai Egyetemen gyógyszervegyészeti témában kutatott tovább.

Mindeközben egy pékséget üzemeltetett, majd otthagyta a tudományt, és elment írónak. Egy barátja unszolására tért vissza a kutatói életbe, és elfogadott egy állást a nem sokkal korábban alapított Cetus biotechnológiai cégnél, ahol DNS-szekvenálás és mesterséges oligonukleotidok növesztése volt a feladata.  Így érkezünk 1983 májusához, amikor azt a feladatot kapja, hogy a sarlósejtes vérszegénység genetikai hátterének kutatásához készítsen használható oligonukleotid-próbákat. Az addig alkalmazott módszert azonban túlságosan körülményesnek találta, ezért változtatott rajta.
Egy második kezdő kódsorozat (vagyis primer) hozzáadásával elérte, hogy a DNS mindkét szála egyszerre másolódjon. Mullis felismerte, hogy így láncreakció indulhat be, ami a DNS meghatározott részletének döbbenetes felszaporítását eredményezheti.

a PCR ciklusok során a DNS darabkék megsokszorozhatók:

a PCR ciklusok során a DNS darabkék megsokszorozhatók:

Most jött el a pillanat, amikor érdemes áttekintenünk a polimeráz-láncreakció mikéntjét. A PCR célja tehát az, hogy a DNS (vagy RNS) rövid szakaszát felszaporítsuk a mintában. Az így megsokszorozott szakaszok hossza általában nem nagyobb, mint 10 kilobázis, vagyis 10 ezer nukleotid. A mai PCR-berendezésekben a folyamat már teljesen automatizált, betöltik a mintát és alapanyagokat, és a gép ripsz-ropsz elvégzi az egész műveletet.

A művelet alapvetően fázisok ciklikus váltakozásán alapszik, amelyeket kívülről leginkább eltérő hőmérsékletük különböztet meg egymástól. Az eljárásban megsokszorozandó génszakaszt a templát nukleinsav tartalmazza (ez a koronavírus esetében a fertőzéssel gyanúsított személytől vett minta). A primerek olyan, néhány tucat építőegység hosszúságú nukleinsav-darabkák, amelyek képesek hozzákötődni a megsokszorozandó génszakasz elejéhez és végéhez. Ezzel kijelölik azt a területet, amelyet a másolóenzimnek (a polimeráznak) kopíroznia kell. A láncreakció létrejöttéhez még hozzá kell adni magát a polimerázt, és azokat a szabad nukleotidokat (építőelemeket), amelyekből felépítheti a lemásolt szakaszt.

a DNS mintákat ilyen csövek rejtik

a DNS mintákat ilyen csövek rejtik

A tipikus PCR-folyamat húsz-harminc ismétlődő ciklusból áll, amelyek egyenként három szakaszt tartalmaznak, ezek a denaturálás, a kapcsolódás és a lánchosszabbítás. Denaturáláskor szinte felforralják, 94 Celsius-fokra hevítik a nukleinsavat, aminek hatására denaturálódik, tehát a két szál elválik egymástól. A második szakaszban 50 fok körülire hűtik a mintát, és ilyenkor kapcsolódnak a primerek a szétválasztott szálak mindegyikéhez. Ezután 72 fokra hevítik a mintát, és ekkor lép működésbe a Taq polimeráz, ami a primerekből indulva elkezdi felépíteni az új szálat.

Ezt addig hagyják futni, amíg a kívánt hosszúságú szakasz létre nem jön. Ezután a kompatibilis szakaszok összekapcsolódnak, és a ciklus újrakezdődik. Ideális esetben a kívánt szakasz mennyisége minden ciklusban megduplázódik, így a 30. ciklus végén akár 230-szor, vagyis 1.073.741.824-szor annyi kópia lehet a mintában, mint eredetileg volt.

A Nobel-Díjátadás előtt lézermutatós játszadozásért letartóztatták

Mullis kezdetben nem alkalmazott ciklikus melegítést és hűtést, de néhány hónapon belül rájött, hogy ez elengedhetetlen. A technológia alapjai letétettek, de a neheze csak ezután jött: el kellett fogadtatni a kollégákkal, hogy az eljárás működőképes. Ez sem a cégen belül, sem azon kívül nem volt egyszerű. A szabadalmat csak 1987-ben jegyezte be a szabadalmi hivatal. Az eljárást több konferencián is bemutatták, de nem keltett szinte semmilyen visszhangot. Két tudományos cikket terveztek: egy elméleti tanulmányt Mullistól, és egy alkalmazott cikket az egész kutatócsoporttól. Az elsőt elutasította a Nature, a második megjelent a Science-ben.

Kary Mullis végül megdicsőült, és megkérdőjelezhető későbbi nyilatkozatai ellenére is egyike maradt kora legtöbbre tartott tudósainak. De ez alig mentette meg őt attól, hogy a Nobel-díjat elfogadó beszéde előtt néhány órával le ne tartóztassa a svéd rendőrség „a lézermutató nem megfelelő használata miatt”. Mint később elmesélte, előző nap kapta a pointert egy barátjától ajándékba, és akkoriban (1993-ban) ez akkora szám volt, hogy nem bírta abbahagyni a vele való játékot.

A stockholmi szállodájának ablakából a lenti járókelőket „lőtte a lézerrel”, amit ő jó mókának tartott. A svédek azonban nem, mert egy évvel korábban történt Stockholmban egy gyilkosság, amikor az orvlövész egy lézerirányzékos puskát használt. Az áldozat mellkasán először megjelent a kis piros fénypont, majd golyó hatolt a szívébe. Emiatt az egyik megviccelt ember nem vette jó néven a játékot, és kihívta a rendőrséget. A rendőrök még Mullisnál is kellemetlenebbül érezték magukat, amikor be kellett kopogniuk a Nobel-díjas szobájába arról érdeklődni, hogy a lézermutatója véletlenül nincs-e egy puskához erősítve.

Cikk küldése e-mailben

Vélemény, hozzászólás?