Az elszabadult láncreakció, ami megváltoztatta a molekuláris biológiát – ezért hívják PCR- tesztnek a COVID-kimutatás módszerét

Több mint nyolcmilliárd dollárra büntették a Purdue gyógyszergyárat az opiátválságban játszott szerepéért
2020-10-23
Szabadkereskedelmi megállapodást írt alá Nagy-Britannia és Japán
2020-10-24
Show all

Az elszabadult láncreakció, ami megváltoztatta a molekuláris biológiát – ezért hívják PCR- tesztnek a COVID-kimutatás módszerét

Ha van olyan rövidítés, ami meghatároz egy teljes évet, akkor az idén ez egyértelműen a PCR, vagyis a polimeráz-láncreakció. A koronavírus megbízhatónak tekintett kimutatása e ma már rutinszerű laboratóriumi eljáráson alapszik. Általa vált lehetővé, hogy a mintákban szinte elhanyagolható mennyiségben jelen lévő genetikai anyagot kimutathatóvá szaporítsuk. De a hepatitisz-C vírus idei orvosi Nobel-díjjal jutalmazott felfedezése ugyancsak lehetetlenség lett volna a technológia nélkül. Miközben a PCR-t vitán felül a molekuláris biológia legnagyobb mérföldkövei között fogja számontartani a tudománytörténet, kifejlesztője már nem az a hősfigura, akire szívesen nézne föl mindenki.

Kevés Nobel-díjas tudós van, akinek nekrológjában fontosnak tartják kiemelni, hogy „fura” (weird) volt. A közvélemény nem is annyira legnagyobb alkotását, a polimeráz-láncreakciót jegyezte meg róla, hanem sokkal könnyebben értelmezhető megnyilvánulásait: amikor kétségbe vonta a globális felmelegedés tényét, vagy amikor nem hitte el, hogy a HIV okozza az AIDS-et, esetleg, amikor szakértőként segítette O. J. Simpson ügyvédeit, miközben az amerikai futballista-filmsztárt felesége megölésével vádolták.

Kary Mullis e performanszaihoz képest az már szinte említésre sem méltó, hogy céget alapított, amely hírességek DNS-ét tartalmazó ékszereket árult. Ennek ellenére, amikor tavaly augusztusban, 74 éves korában tüdőgyulladásban elhunyt, a közelmúlt legnagyobb hatású tudósai között tartották számon. Méghozzá egy dolog miatt, ez pedig a PCR kifejlesztése. Az eljárásért 1993-ban (egészen fiatalon, 48 évesen) megkapta a megosztott kémiai Nobel-díjat. Bár a kitüntetést Michael Smith-szel közösen kapták, a PCR felfedezésének érdeme szinte teljes egészében az övé, Smith a sokkal kevésbé ismert folyamat, az oligonukleotid alapú mutagenezis felfedezéséért részesült az elismerésben.

Kary Mullis a felfedező

Kary Mullis a felfedező

A PCR fontosságához tudni kell, a molekuláris biológusok mindig is azzal az alig megoldható
problémával voltak kénytelenek szembenézni, hogy a vizsgálni kívánt gének gyakorlatilag kimutathatatlanul kis mennyiségben vannak jelen a mintában. Erre kínált hatékony és nagyon gyors megoldást a polimeráz-láncreakció (PCR), amelynek segítségével sok nagyságrenddel lehetett felszaporítani a megcélzott génszakaszt.

A Nature először elutasította a PCR-ről beszámoló cikket

Mullis nem a semmiből találta fel a polimeráz-láncreakciót, hiszen ehhez szüksége volt a gének működésének ismeretére. Ahogy az sem következik az 1985-ös eredményeket egészen gyorsan, nyolc évvel később követő díjazásból, hogy a tudóst és vívmányát már a kezdet kezdetén a keblére ölelte volna a tudományos közösség. Olyannyira nem, hogy a PCR kifejlesztéséről beszámoló közlemény nem kellett a Nature-nek, végül a Methods in Enzymology szakfolyóirat hozta le. A világ legnagyobb tudományos folyóiratának szerkesztői valószínűleg nem ezt az elutasítást tartják pályafutásuk legjobb döntésének.

De hogyan is működik a polimeráz-láncreakció, és miért bizonyult paradigmaváltónak a biotechnológiában? Ahogy minden a molekuláris genetikában, e történet is az örökítő anyag, a DNS kettős spirál-szerkezetének 1953-as felfedezésével kezdődik. James Watson és Francis Crick rövidke tanulmányukat e mondattal zárták:

Nem kerülte el figyelmünket, hogy a [nukleotidok – a DNS-t alkotó bázis részegységek] általunk felvázolt specifikus párba állása azonnal valószínűsíti a genetikai anyag lehetséges másolómechanizmusát.

Vagyis tisztában voltak azzal, hogy ilyen komplex szerkezet nem jöhet létre csak úgy magától, hanem csak erre szakosodott molekuláris eljárások, s az ezt végző vélhetően enzimek révén. De ezeket az enzimeket abban a pillanatban még senki sem ismerte.

Az újabb áttörésre csak négy évet kellett várni, amikor Arthur Kornberg (aki e történet sok más szereplőjéhez hasonlóan ugyancsak Nobel-díjat kapott két évvel később ötletéért), a St Louis-i Washington Egyetem kutatója felfedezte a DNS másolásának mechanizmusát, vagyis a DNS-polimeráz enzimet. Az adatokból úgy tűnt, hogy az enzim meglehetősen finnyás, és nagyon jól előkészített körülményeket igényel a működéséhez. Jelesül csak szétválasztott, tehát egyszálú DNS-en tud dolgozni, szüksége van kezdeti, primer szakaszra az elinduláshoz, majd ezután csak egy irányban tud haladni a hosszú molekulaláncon.

Hamarosan kiderült, hogy a DNS lemásolásához egész sor enzimre van szükség. Külön enzim gondoskodik a spirálszerű kettős DNS-lánc zipzárszerű szétválasztásáról, egy másik arról, hogy e szálak ne kapcsolódjanak azonnal össze újból. Újabb enzim készíti a primert (vagyis azt a kódsorozatot, amelynél a másolóenzim elkezdi a munkát), a polimeráz enzim építi fel a DNS-t a különálló nukleotidokból (nukleinsav-építőelemekből), majd egy másik fehérje távolítja el a
primert és egy következő illeszti össze a szálakat.

A következő negyedszázad fokozatos, de folyamatos fejlődéssel telt. Az indiai-amerikai Gobind Khorana feltárta a genetikai kód működését, és megtette az első lépéseket a mesterséges nukleinsavak létrehozásának irányába (természetesen ő is Nobel-díjas, 1968-ból). Elkezdte kidolgozni azokat a technológiákat, amelyek segítségével meghatározott szekvenciájú oligonukleotidokat (kevés építőegységet tartalmazó nukleinsav-darabkákat) lehet építeni.

1969-ben a Yellowstone Park egyik hőforrásában egy addig ismeretlen, hőtűrő baktériumot, a Thermus aquaticust (rövidítve Taq) fedeztek fel, amelynek különlegessége az volt, hogy fehérjéi magas hőmérsékleten sem veszítették el működőképességüket. De ne szaladjunk ennyire előre, hiszen a hetvenes években, részben a már szerepelt Gobind Khorana kutatócsoportja egészen közel jutott a PCR-hoz, legalábbis elméleti kontextusban már olyan rendszert vizionáltak, amelyben két enzim, két primerből indulva egymással szemben replikálja a DNS-t.

Csakhogy valószínűleg nem jutottak túl az elméleten, legalábbis nem publikálták az eljárás működőképességét bizonyító kísérletek eredményeit.

A hetvenes évek közepén a Thermus aquaticusból sikerült izolálni a Taq polimerázt, amely a forróságban (75 Celsius-fokon) sem ment tönkre, és e tulajdonsága esszenciális lesz később, a PCR melegítési fázisában. Egy évvel később (az 1980-ban Nobel-díjban részesült) Frederick Sanger új alapokra helyezte a DNS-szekvenálást. Sanger Nobel-díja átadásának idején – bár ezt természetesen akkor senki sem sejtette – valójában már minden tudásnak a birtokában volt az emberiség, ami a PCR-hoz szükséges. A DNS-polimerázt is rutinszerűen használták a laborokban az oligonukleotidok lánchosszabbítására. Csak az isteni szikra hiányzott.

Mullis útja asztrofizikától a pékségen át az íróságig

Itt lép a történetbe Kary Mullis, aki már az egyetemen sem volt átlagos képességű hallgató, hiszen kevesen vannak, akik a diploma előtt egyszerzős tanulmányt közölnek a Nature-ben. Ez a cikk egyébként kozmológiai témájú volt, mert Mullist akkor épp az asztrofizika érdekelte. Aztán biokémiai doktorálása után a Kansasi Egyetemen végzett posztdoktori kutatásokat a gyermek kardiológia területén, majd a San Franciscó-i Kaliforniai Egyetemen gyógyszervegyészeti témában kutatott tovább.

Mindeközben egy pékséget üzemeltetett, majd otthagyta a tudományt, és elment írónak. Egy barátja unszolására tért vissza a kutatói életbe, és elfogadott egy állást a nem sokkal korábban alapított Cetus biotechnológiai cégnél, ahol DNS-szekvenálás és mesterséges oligonukleotidok növesztése volt a feladata.  Így érkezünk 1983 májusához, amikor azt a feladatot kapja, hogy a sarlósejtes vérszegénység genetikai hátterének kutatásához készítsen használható oligonukleotid-próbákat. Az addig alkalmazott módszert azonban túlságosan körülményesnek találta, ezért változtatott rajta.
Egy második kezdő kódsorozat (vagyis primer) hozzáadásával elérte, hogy a DNS mindkét szála egyszerre másolódjon. Mullis felismerte, hogy így láncreakció indulhat be, ami a DNS meghatározott részletének döbbenetes felszaporítását eredményezheti.

a PCR ciklusok során a DNS darabkék megsokszorozhatók:

a PCR ciklusok során a DNS darabkék megsokszorozhatók:

Most jött el a pillanat, amikor érdemes áttekintenünk a polimeráz-láncreakció mikéntjét. A PCR célja tehát az, hogy a DNS (vagy RNS) rövid szakaszát felszaporítsuk a mintában. Az így megsokszorozott szakaszok hossza általában nem nagyobb, mint 10 kilobázis, vagyis 10 ezer nukleotid. A mai PCR-berendezésekben a folyamat már teljesen automatizált, betöltik a mintát és alapanyagokat, és a gép ripsz-ropsz elvégzi az egész műveletet.

A művelet alapvetően fázisok ciklikus váltakozásán alapszik, amelyeket kívülről leginkább eltérő hőmérsékletük különböztet meg egymástól. Az eljárásban megsokszorozandó génszakaszt a templát nukleinsav tartalmazza (ez a koronavírus esetében a fertőzéssel gyanúsított személytől vett minta). A primerek olyan, néhány tucat építőegység hosszúságú nukleinsav-darabkák, amelyek képesek hozzákötődni a megsokszorozandó génszakasz elejéhez és végéhez. Ezzel kijelölik azt a területet, amelyet a másolóenzimnek (a polimeráznak) kopíroznia kell. A láncreakció létrejöttéhez még hozzá kell adni magát a polimerázt, és azokat a szabad nukleotidokat (építőelemeket), amelyekből felépítheti a lemásolt szakaszt.

a DNS mintákat ilyen csövek rejtik

a DNS mintákat ilyen csövek rejtik

A tipikus PCR-folyamat húsz-harminc ismétlődő ciklusból áll, amelyek egyenként három szakaszt tartalmaznak, ezek a denaturálás, a kapcsolódás és a lánchosszabbítás. Denaturáláskor szinte felforralják, 94 Celsius-fokra hevítik a nukleinsavat, aminek hatására denaturálódik, tehát a két szál elválik egymástól. A második szakaszban 50 fok körülire hűtik a mintát, és ilyenkor kapcsolódnak a primerek a szétválasztott szálak mindegyikéhez. Ezután 72 fokra hevítik a mintát, és ekkor lép működésbe a Taq polimeráz, ami a primerekből indulva elkezdi felépíteni az új szálat.

Ezt addig hagyják futni, amíg a kívánt hosszúságú szakasz létre nem jön. Ezután a kompatibilis szakaszok összekapcsolódnak, és a ciklus újrakezdődik. Ideális esetben a kívánt szakasz mennyisége minden ciklusban megduplázódik, így a 30. ciklus végén akár 230-szor, vagyis 1.073.741.824-szor annyi kópia lehet a mintában, mint eredetileg volt.

A Nobel-Díjátadás előtt lézermutatós játszadozásért letartóztatták

Mullis kezdetben nem alkalmazott ciklikus melegítést és hűtést, de néhány hónapon belül rájött, hogy ez elengedhetetlen. A technológia alapjai letétettek, de a neheze csak ezután jött: el kellett fogadtatni a kollégákkal, hogy az eljárás működőképes. Ez sem a cégen belül, sem azon kívül nem volt egyszerű. A szabadalmat csak 1987-ben jegyezte be a szabadalmi hivatal. Az eljárást több konferencián is bemutatták, de nem keltett szinte semmilyen visszhangot. Két tudományos cikket terveztek: egy elméleti tanulmányt Mullistól, és egy alkalmazott cikket az egész kutatócsoporttól. Az elsőt elutasította a Nature, a második megjelent a Science-ben.

Kary Mullis végül megdicsőült, és megkérdőjelezhető későbbi nyilatkozatai ellenére is egyike maradt kora legtöbbre tartott tudósainak. De ez alig mentette meg őt attól, hogy a Nobel-díjat elfogadó beszéde előtt néhány órával le ne tartóztassa a svéd rendőrség „a lézermutató nem megfelelő használata miatt”. Mint később elmesélte, előző nap kapta a pointert egy barátjától ajándékba, és akkoriban (1993-ban) ez akkora szám volt, hogy nem bírta abbahagyni a vele való játékot.

A stockholmi szállodájának ablakából a lenti járókelőket „lőtte a lézerrel”, amit ő jó mókának tartott. A svédek azonban nem, mert egy évvel korábban történt Stockholmban egy gyilkosság, amikor az orvlövész egy lézerirányzékos puskát használt. Az áldozat mellkasán először megjelent a kis piros fénypont, majd golyó hatolt a szívébe. Emiatt az egyik megviccelt ember nem vette jó néven a játékot, és kihívta a rendőrséget. A rendőrök még Mullisnál is kellemetlenebbül érezték magukat, amikor be kellett kopogniuk a Nobel-díjas szobájába arról érdeklődni, hogy a lézermutatója véletlenül nincs-e egy puskához erősítve.

Vélemény, hozzászólás?

Weboldalunk bizonyos funkcióinak működéséhez és a célzott hirdetésekhez sütikkel gyűjt névtelen látogatottsági információkat. Az Elfogadom gombra kattintva a webhely használatával Ön elfogadja a weboldal sütikre vonatkozó aktuális adatévelmi irányelveinket. További információért kattintson ide.

The cookie settings on this website are set to "allow cookies" to give you the best browsing experience possible. If you continue to use this website without changing your cookie settings or you click "Accept" below then you are consenting to this.

Close